PCR技術(shù)是一項(xiàng)很強(qiáng)大的技術(shù)手段，當(dāng)然也是考試的重點(diǎn)了。今天重點(diǎn)說一下PCR技術(shù)應(yīng)用之一：OverlapPCR技術(shù)---基因定點(diǎn)突變

1. 基因定點(diǎn)突變：將某基因中的一個(gè)或者幾個(gè)堿基替換（補(bǔ)充說明也可以增加或者缺失堿基對(duì)）成其它堿基，導(dǎo)致基因中的部分堿基序列發(fā)生改變（也就是我們說的遺傳信息發(fā)生改變），實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變。

2. 回顧一下強(qiáng)大的PCR技術(shù)原理：

結(jié)論：

 通過上圖可以發(fā)現(xiàn)，只要設(shè)計(jì)出DNA上某一段片段（本圖也就是藍(lán)色的目的基因片段）兩側(cè)的一對(duì)方向相反的引物，那么這一對(duì)引物，所夾的那段（本圖就是目的基因）經(jīng)過至少三輪的DNA復(fù)制（擴(kuò)增）就會(huì)得到中間的那段目的基因。

3.應(yīng)用OverlapPCR技術(shù)：如下圖,采用具有互補(bǔ)末端的引物(b與c兩個(gè)引物互補(bǔ)），使PCR的產(chǎn)物形成一段重疊鏈，然后通過重疊部分的延伸，將來源不同的擴(kuò)增片段重疊拼接的技術(shù)。

4.使用OverlapPCR技術(shù)使基因的定點(diǎn)突變。

大概的過程：

（1）首先在需要突變的位點(diǎn)設(shè)計(jì)一個(gè)突變的引物對(duì)，這對(duì)引物對(duì)于基因來說位于中央位置，如上圖的Fm和Rm，帶紅色標(biāo)記的是替換成別的堿基，比如正常是C可以換成T等方法，當(dāng)然Fm和Rm位于突變區(qū)域的相同位置而且需要反向互補(bǔ)，能夠進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)。同時(shí)還應(yīng)設(shè)計(jì)他們對(duì)應(yīng)的引物，也就是基因兩端的，像上圖的F和R引物。

（2）設(shè)計(jì)好上述的引物：第一輪PCR---分別R和Fm，F(xiàn)和Rm為引物對(duì)擴(kuò)增(也可以分兩次做PCR），根據(jù)我上面說的PCR的結(jié)論就可以得到左右兩部分的DNA片段，關(guān)鍵會(huì)出現(xiàn)相同也就是一樣的一段---突變位點(diǎn)那部分；

（3）擴(kuò)增完成后的產(chǎn)物同時(shí)為模板進(jìn)行下一輪的PCR，因?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)倆區(qū)域可以堿基互補(bǔ)配對(duì)而連接起來，這樣可以將來源不同的擴(kuò)增片段重疊拼接起來，然后引物的作用下延伸，最后在引物R和F擴(kuò)增出大量的突變基因。這樣可能還是有點(diǎn)模糊和疑問。

4.為此生物頌100的小崔老師專門找到了北京市海淀區(qū)（2018年期中）考過一個(gè)相關(guān)的的題，可以應(yīng)用一下。

練習(xí).（2018海淀期中，34）蘿卜的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對(duì)人體沒有影響。我國(guó)科學(xué)家欲獲得高效表達(dá)蛋白A的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌作為微生物農(nóng)藥，做了相關(guān)研究。

（1）研究者用相同的_________酶處理蛋白A基因和pET質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒置于經(jīng)_________處理的大腸桿菌細(xì)胞懸液中，獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。

（2）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入的蛋白A基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)效率很低，研究者推測(cè)不同生物對(duì)密碼子具有不同的偏好，因而設(shè)計(jì)了與蛋白A基因結(jié)合的兩對(duì)引物（引物B和C中都替換了一個(gè)堿基），并按圖2方式依次進(jìn)行4次PCR擴(kuò)增，以得到新的蛋白A基因。

①這是一種定點(diǎn)的_________技術(shù)。

②圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物？請(qǐng)?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。

引物A

引物B

引物C

引物D

PCR1

PCR2

PCR3

PCR4

（3）研究者進(jìn)一步將含有新蛋白A基因的重組質(zhì)粒和_________分別導(dǎo)入大腸桿菌，提取培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)，用_________方法檢測(cè)并比較三組受體菌蛋白A的表達(dá)產(chǎn)物，判斷新蛋白A基因表達(dá)效率是否提高。為檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，研究者將上述各組表達(dá)產(chǎn)物加入到長(zhǎng)滿了植物病菌的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，比較_________的大小，以確定表達(dá)產(chǎn)物的生物活性大小。

（4）作為微生物農(nóng)藥，使用時(shí)常噴灑蛋白A基因的發(fā)酵產(chǎn)物而不是轉(zhuǎn)蛋白A基因的大腸桿菌，其優(yōu)點(diǎn)是_________。

 本題答案：

（1）限制酶和DNA連接    CaCl2

（2）①基因突變

②如下表所示。注：正確填寫PCR1、PCR2、PCR3、PCR4的引物組合之一，每填對(duì)一個(gè)得1分。共4分。

引物A

引物B

引物C

引物D

PCR1

√

√

×

×

PCR2

×

×

√

√

PCR3

×

×

×

×

PCR4

√

×

×

√

（3）含有蛋白A基因的重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒（pET質(zhì)粒）  抗原-抗體雜交   抑菌圈

（4）對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全；不會(huì)造成基因污染；有效成分純度較高。（答對(duì)一點(diǎn)或其他合理答案均可得分）

通過這道題，你對(duì)PCR定點(diǎn)突變的應(yīng)用應(yīng)該有了更深一層的認(rèn)識(shí)，如果還是有疑問可以查閱相關(guān)資料或者加我微信18310709058我們一起探討一下。PCR技術(shù)還有很多應(yīng)用：如檢測(cè)基因型，分子克隆，基因敲除等，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測(cè)和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。

備注：小編能力有限，如有不足之處，希望批評(píng)指正，信息僅供參考學(xué)習(xí)。

參考資料：

1.黃立華，梁山，谷峻等著 ?！斗肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，科學(xué)出版社。

2.http://pic.sogou.com/pics?query=pcr%B6%A8%B5%E3%CD%BB%B1%E4%CA%BE%D2%E2%CD%BC&p=40230500&st=255&mode=255&policyType=0；

3.https://baike.sogou.com/v483259.htm?fromTitle=%E5%AE%9A%E7%82%B9%E7%AA%81%E5%8F%98

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　備注：信息僅供參考學(xué)習(xí)，如有不足望批評(píng)指正。